猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞定位及细胞因子表达的影响

【摘要】猪流感(swineinfluenza,SI)是由猪流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)引起的一种急性、传染性和群发性呼吸道疾病。NS1(non-structural1)蛋白是病毒重要的调控蛋白,是病毒感染期间重要的毒力因子,通过多种机制抵抗宿主抗病毒应答。对NS1蛋白的研究发现,NS1蛋白影响宿主免疫系统的功能,与NS1蛋白上的特定氨基酸位点密切相关。本研究拟对NS1关键氨基酸位点进行突变,分析表达蛋白对细胞内干扰素(IFN-α/β)和肿瘤坏死因子(TNF-a)的影响,进一步明确NS1抑制干扰素产生机理,为防治猪流感提供理论依据。研究扩增了猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1基因,克隆到pCAGGS表达载体,构建重组表达载体pCAGGS-NS1,经PCR和酶切鉴定,获得阳性克隆,序列分析表明NS1基因序列正确,无突变。设计引物,分别对42、92、42/92位氨基酸进行突变,构建了pCAGGS-NS1S42P,pCAGGS-NS1D92EpCAGGS-NS1S42P/D92E重组表达载体。提取pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1S42P,pCAGGS-NS1D92E.pCAGGS-NS1S42P/D92E质粒,转染A549和293T细胞,经Westernblot鉴定,NS1基因在A549和293T细胞中成功表达。重组质粒转染A549细胞,利用抗NS1多克隆抗体,进行间接免疫荧光检测,观察不同重组表达蛋白的细胞定位情况。结果发现,重组表达蛋白主要分布在细胞核中,少量分布在细胞质中。NS1蛋白与NP蛋白之间的互作研究发现,在pCAGGS-NS1质粒和pCAGGS-NP质粒共转染的293T细胞中,NS1蛋白与NP蛋白存在结合.提取经Poly(I:C)刺激的293T细胞总RNA,以β-actin为内参照,建立检测人源细胞IFN-α/βmRNA和TNF-amRNA的半定量检测方法,用来分析pCAGGS-NS1,pCAGGS-NS1S42P>PCAGGS-NS1D92E,pCAGGS-NS1S42P/D92E重组质粒转染细胞的IFN-α/βmRNA和TNF-amRNA水平；同时用ELISA方法,检测IFN-α/β和TNF-a在细胞中的表达情况。结果,pCAGGS-NS1S42P转染组能够明显增强IFN-βmRNA转录水平,与pCAGGS-NS1组比较差异极显著(P<0.01),IFN-amRNA转录水平差异显著(0.01<P<0.05),TNF-amRNA转录水平与pCAGGS-NS1转染组相比差异不显著(P>0.05).pCAGGS-NS1D92E和PCAGGS-NS1S42P/D92E(?)染组与pCAGGS-NS1转染组相比,IFN-a/β和TNF-amRNA水平无明显变化(P>0.05)。ELISA检测显示,PCAGGS-NS1S42P转染组能够明显增高IFN-P在细胞中的表达,与pCAGGS-NS1转染组比较差异极显著(P<0.01),IFN-a表达水平差异显著(0.01<P<0.05)；TNF-a表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)。PCAGGS-NS1D92E和pCAGGS-NS1S42P/D92E转染组与pCAGGS-NS1转染组相比,对IFN-a/β和TNF-α的表达水平差异不显著(P>0.05)。目前发现NS1蛋白有两种不同形式,为分析NS1蛋白差异是否影响感染细胞内IFN-α/β和TNF-α的表达,研究选择A/swine/Zhejiangi/1/2007株和A/swine/Shanghai/1/2007株,NS1蛋白分别为219个氨基酸/24kD,230个氨基酸/26kD,分别感染293T细胞,ELISA检测细胞因子表达差异。结果,两株病毒感染组均能明显增高IFN-a/β和TNF-α在细胞中的表达,与未感染组比较差异极显著(P<0.01),但两组之间差异不显著(P>0.05)。将两株病毒分别免疫BALB/c小鼠,48h后用流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+和CD8+水平。结果,与PBS组相比,病毒感染组能明显提高CD4+T细胞亚群的百分率,CD8+T细胞亚群的百分率及CD4+/CD8+比值略有提高,但两感染组之间差异不明显(P>0.05)。
【作者】王柏宁；
【导师】刘永杰；刘惠莉；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪流感病毒；NS1基因；蛋白定位；IFN-α/β；TNF-α；流式细胞；

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